Azotobacter

Azotobacter – род конечно подвижных, овальных или сферических свободноживущих грамотрицательных бактерий-диазотрофы, что в неблагоприятных условиях формируют окружены толстой стенкой цисты и могут производить значительное количество капсулярного слизи. Представители рода найдены прежде всего в нейтральных и щелочных почвах, в водных средах и в ассоциации с некоторыми растениями. Представители рода имеют несколько важных метаболических способностей, в частности они фиксируют азот, прететворюючы его на аммиак. Некоторые виды Azotobacter имеют наивысшую скорость метаболизма среди всех известных организмов.
Представители Azotobacter широко изучаются и как модельный организм и за возможного применения в биотехнологии. Их уникальная система трех ферментов нитрогеназы делает этих бактерий очень интересными для ученых, изучающих фиксацию азота. Они могут применяться для производства альгиновой кислоты, искусственной фиксации азота и производства некоторых биополимеров.
Первый представитель рода, Azotobacter chroococcum, был открыт и описан в 1901 году голландским микробиологом и ботаником Мартинус Бейеринком. На данный момент в состав рода входят шесть видов.
Биологические свойства
Морфология
Клетки представителей рода Azotobacter: видно палочковидные и коку клетки разного размера. Окраска железным гематоксилином по Гейденгайну. Клетки бактерий рода Azotobacter среднего размера (1-2 микрон в диаметре), обычно овальные, но обладают плеоморфизм, т.е. могут иметь разную форму – от палочковидной к сферической. На микроскопических препаратах клетки могут располагаться поодиночке, парами, неправильными скоплениями или, изредка, цепочками различной длины. Также могут формировать спящие формы – цисты, тогда как настоящих спор не образуют.
В культуре клетки движущиеся с помощью многочисленных жгутиков. За ухудшением условий клетки теряют подвижность, приобретают почти кокоподобную форму и образуют толстый слой слизи, формирующий капсулу клетки. На форму клетки также влияет наличие некоторых химических компонент среды – пептон, например, вызывает плеоморфизм и индуцирует образование так называемых «грибовидных» клеток. Индуцирующий влияние на плеоморфизм в культурах представителей рода в составе пептона оказывает аминокислота глицин.
При микроскопии в клетках наблюдаются включения, часть из которых окрашивается многими красителями (например, железным гематоксилином), а часть остается бесцветным. В начале 20 века считалось, что закрашенные включения являются «репродуктивными гранулами» (гонидиямы) и участвуют в размножении клетки, выполняя роль своеобразных «зародокових клеток», хотя позже эта гипотеза была опровергнута. Сейчас известно, что закрашенные гранулы состоят из волютина (типа нуклеопротеинов), а бесцветные является каплями жира. Поскольку никакой другой функции гранул показано не было, считается, что они являются резервным источником питания.
Цисты
Циста Azotobacter: видно центральное тело с вакуолями и многослойную оболочку Цисты представителей рода Azotobacter устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, чем вегетативные клетки – так, цисты в два раза более устойчивы к воздействию ультрафиолетового излучения, устойчивы к высушиванию, гамма-излучения, солнечной радиации, действия ультразвука, однако не являются устойчивыми к действию высоких температур.
Формирование цист (инцистування) индуцируется изменением концентрации питательных веществ в питательной среде и добавлением некоторых органических веществ (например этанола, н-бутанола и ?-гидроксибутирату). Цисты редко образуются в жидких питательных средах. Образование цист сопровождается метаболическими изменениями, в частности изменениями в катаболизме, дыхании и биосинтезе макромолекул. В процессе образования цисты участвуют много белков клетки, в частности определенное значение имеют альдегиддегидрогеназа и регулятор ответа AlgR.
Циста Azotobacter – сферическое тело, состоящее из так называемого центрального тела: уменьшенной копии вегетативной клетки с большим количеством вакуолей, и двухслойной оболочки, внутренняя часть которой называется интима и имеет волокнистое строение, а внешняя называется екзины и представлена ровной структурой, окружающей цисту и имеет гексагональную кристаллическую структуру. Екзины частично гидролизуется трипсином и устойчива к действию лизоцима, в отличие от центрального тела. Центральное тело может быть изолировано в жизнеспособном состоянии некоторыми хелатирующими агентами. Главными компонентами внешней оболочки цисты являются алкилрезорцинолы, состоящие из длинных алифатических цепей и ароматических колец, эти вещества встречаются также в других бактерий, животных и растений.
Прорастание цист
Цисты Azotobacter являются спящими формами клетки, необходимыми для переживания неблагоприятных условий внешней среды, но не предназначенными для размножения. После восстановления благоприятных условий, таких, как значение кислотности, температуры и наличия доступного источника углерода, цисты прорастают, в результате чего образуются вегетативные клетки, вновь размножается путем бинарного деления. При прорастании цист екзины цисты повреждается, и высвобождается большая вегетативная клетка.
При наблюдении первым проявлением прорастания спор является постепенное снижение преломление света цистами, заметное при фазово-контрастной микроскопии или измерении рассеяния света. Прорастание цист – медленный процесс, длящийся около 4-6 часов, на протяжении которых центральное тело увеличивается и происходит захват гранул волютина, ранее находившиеся в интиме. Затем екзины лопается и вегетативная клетка характерной подковообразной формы высвобождается из екзины. При прорастании цисты снова происходят метаболические изменения. Сразу после увеличения концентрации источника углерода цисты начинают поглощать кислород и выделять двуокись углерода, в частности скорость дыхания повышается до максимальных значений через 4 часа после увеличения концентрации глюкозы. Биосинтез белков и РНК также начинается после увеличения концентрации источника углерода в среде, однако активизация синтеза макромолекул происходит медленнее после увеличения концентрации источника углерода. Так, синтез ДНК и фиксация азота инициируются через 5 часов после увеличения концентрации глюкозы в безазотистыми питательной среде.
Во время прорастания цист происходят изменения и в интиме, видимые на электронно-микроскопических снимках. Интима состоит из углеводов, липидов и белков и занимает почти такой же объем клетки, и центральное тело. Во время прорастания цист интима гидролизуется и используется клеткой для синтеза ее компонентов.
Физиологические свойства
Бактерии Azotobacter получают энергию в ходе окислительно-восстановительных реакций, используя в качестве донора електорону органические соединения. Для роста им необходим кислород, но они способны расти при пониженных концентрациях кислорода, образуют каталазу и оксидазу. Способны использовать различные углеводы, спирты и соли карбоновых кислот как источника углерода. Эти бактерии – диазотрофы (азотфиксаторив), фиксирующие менее 10 мг азота на грамм потребленной глюкозы, фиксация азота зависит от наличия ионов молибдена, отсутствие молибдена может быть частично замещена ионами ванадия. Качестве источника азота могут использовать нитраты, ионы аммония и аминокислоты. Оптимальная кислотность для роста и фиксации азота – pH 7,0-7,5, но клетки способны расти в диапазоне pH от 4,8 до 8,5. Возможен также зависим от водорода миксотрофных рост представителей рода безазотистыми питательные среде, содержащей маннозу. Поскольку водород доступен в почве, вероятно миксотрофия этих бактерий происходит и в естественных условиях.
Культуральные свойства
Представители рода Azotobacter способны использовать углеводы (например маннитол, сахароза, глюкозу), спирты (в частности этанол и бутанол) и соли органических кислот, в частности и бензоаты, как источник углерода и энергии. Представители рода растут на безазотистых средах, предназначенных для выделения свободноживущих азотфиксирующих и олигонитрофильних организмов, например на среде Эшби, содержащей источник углерода (маннит, сахароза или глюкоза) и необходимые микроэлементы (источник фосфора, серы и т. д.), или на среде Федорова, содержащей больше микроэлементов, а также в жидкой среде Бейеринка.
На твердых питательных средах представители рода образуют плоские, слизистые колонии пастообразной консистенции диаметром 5-10 мм, в жидких питательных средах образуют биопленки. Характерна также пигментация, колонии представителей рода могут быть окрашены в темно-коричневый, зеленый и другие цвета, или могут быть бесцветными, в зависимости от штамма. Бактерии Azotobacter являются мезофильными микроорганизмами и растут при температуре 20-30 ° C.
Пигменты
Многие представители рода Azotobacter синтезируют разнообразные пигменты. Например, типичный вид рода Azotobacter chroococcum производит темно-коричневый водорастворимый пигмент (в видовом эпитете раз отражена эта способность) меланин. Продукция меланина у A. chroococcum наблюдается при высоких уровнях дыхания во время фиксации азота и, вероятно, также защищает нитрогеназну систему от действия кислорода при аероадаптации. Другие виды рода также продуцируют пигменты от желто-зеленого до пурпурного цвета. Также представители рода способны производить флуоресцентный пигмент, излучающий желто-зеленым цветом, и пигмент, излучает бело-голубым цветом.
Геном
Частично завершено определение нуклеотидной последовательности хромосомы Azotobacter vinelandii штамма AvOP. Хромосома A. vinelandii – кольцевая молекула ДНК размером 5342073 п.н., содержащей 5043 генов, из которых 4988 кодируют белки, содержание ГЦ составляет 65%. Отмечена также изменение плоидности бактерий Azotobacter по мере «старения» культур: количество хромосом в клетках и содержание ДНК увеличивается в стационарной фазе, где бактерии могут содержать более 100 копий хромосомы на клетку. При пересеве на свежий питательную среду первичный содержание ДНК (одна копия) восстанавливается. Кроме хромосомной ДНК, у представителей рода также найдены плазмиды и показана возможность трансформации бактерий экзогенной плазмид.
Систематика
Род Azotobacter был впервые описан в 1901 году голландским микробиологом и ботаником, одним из основателей экологической микробиологии Мартинус Бейеринком на основе впервые выделенного и описанного им вида Azotobacter chroococcum, первого известного аэробного свободноживущего диазотрофы.
Мартинус Виллем Бейеринк (1851-1931) – первооткрыватель бактерий рода Azotobacter В 1903 году Липман (Lipman) описал вид Azotobacter vinelandii Lipman, 1903, а годом позже Azotobacter beijerinckii Lipman, 1904, названный им по имени самого Мартинуса Бейеринка. В 1949 году советский микробиолог Николай Александрович Красильников описал вид Azotobacter nigricans Krasil'nikov, 1949, в 1981 году разделен Томпсоном (Thompson) и Скерманом (Skerman) на два подвида: Azotobacter nigricans subsp. Nigricans Krasil'nikov, 1949 и Azotobacter nigricans subsp. achromogenes Thompson and Skerman, 1981, в том же году Томпсон и Скерман описали вид Azotobacter armeniacus Thompson and Skerman, 1981. В 1991 году Пейдж (Page) и Шивпрасад (Shivprasad) описали микроаэрофильных, зависящий от ионов натрия аеротолерантний вид Azotobacter salinestris Page and Shivprasad 1991.
Сначала род относили к семейству Azotobacteraceae Pribram, 1933, однако позже он был перенесен к семье Pseudomonadaceae, основываясь на молекулярно-систематических исследованиях нуклеотидных последовательностей 16S рРНК. В 2004 году было проведено филогенетическое дослиження, которое выявило, что Azotobacter vinelandii входит в одну клади с бактерией Pseudomonas aeruginosa, а в 2007 году было сделано предположение о близости родов Azotobacter, Azomonas и Pseudomonas и о возможном синонимичность.
К рода Azotobacter ранее также относили виды Azotobacter agilis (в 1938 году перенесен Виноградским к роду Azomonas), Azotobacter macrocytogenes (перенесенный в 1981 году к роду Azomonotrichon, а в 1982 году, с отменой Azomonotrichon, к роду Azomonas) и Azotobacter paspali (перенесен в 1981 году к роду Azorhizophilus).
Распространение
Представители рода распространены повсеместно в нейтральных и слабощелочных почвах, но не выделяются из кислых почв. Также они были найдены и в экстремальных условиях почв северного и южного полярных регионов, несмотря на короткие местные вегетационные сезоны и относительно низкие значения pH, – в арктическом регионе в глине и суглинках (в частности торфяных и песчаных суглинках), в антарктическом регионе – в почве побережья. Численность Azotobacter в почве не очень велика, так в почвах Индии они не превышают 10-100 тыс. / г почвы. Численность этих бактерий сильно зависит от наличия других микроорганизмов: существуют как микроорганизмы, стимулирующие рост Azotobacter, так и те, которые предотвращают их интенсивному росту. В сухих почвах бактерии Azotobacter способны сохраняться в виде цист до 24 лет.
Также бактерии Azotobacter были выделены из водных сред, в частности из пресноводных водоемов, солоневатих болот. Некоторые представители рода ассоциированные с растениями и были найдены в ризосфере, вступая с растениями в определенные взаимоотношения – несколько штаммов рода были выделены из ризосферы мангровых деревьев, совместно с другими азотфиксирующими и Денитрифицирующие бактериями.
Некоторые штаммы Azotobacter также были найдены в коконах дождевых червей Eisenia fetida.
Фиксация азота
Бактерии Azotobacter являются свободноживущими диазотрофы, то есть способны фиксировать атмосферный азот, но в отличие от классических диазотрофы рода Rhizobia, обычно не вступают в симбиотические отношения с растениями, хотя из этого правила есть несколько исключений в пределах рода. Фиксация азота ингибируется наличием доступных источников связанного азота, например ионов аммония или нитратов.
Представители рода имеют полный комплекс ферментов, необходимых для осуществления фиксации азота: ферредоксина, гидрогеназу и важнейшие ферменты – нитрогеназы. Процесс фиксации азота энергозависимый и требует притока энергии в виде АТФ. Также этот процесс крайне чувствителен к присутствию кислорода, поэтому у представителей Azotobacter выработался особый механизм защиты от действия кислорода – так называемый дыхательный защита, осуществляемая путем значительного увеличения дыхания, крупнейшей среди всех известных бактерий, что очень значительно снижает концентрацию кислорода в клетках. Также эти бактерии имеют специфический для них белок Shethna, защищающий нитрогеназы и участвует в предотвращении смерти клетки, вызванной кислородным стрессом: мутанты, не производящих этот белок, гибнут по условиям наличии кислорода при фиксации азота (т.е. по условиям отсутствия источника свя связанного азота в среде). Определенную роль в процессе фиксации азота бактериями Azotobacter играют также ионы гомоцитрату.
Нитрогеназа – важнейший фермент фиксации азота

Нитрогеназы Azotobacter
Нитрогеназний комплекс является важнейшим ферментом, участвующим в фиксации азота. У представителей рода выявлено несколько типов нитрогеназы – Mo-Fe-Нитрогеназа и альтернативные нитрогеназы: ванадий-зависимая, активнее, чем Mo-Fe-Нитрогеназа по условиям низких температур (в исследованиях эффективная фиксация азота не прекращалась V-нитрогеназы при понижении температур до 5 ° C, по этим условиям активность V-нитрогеназы снизилась в 10 раз меньше, чем в Mo-Fe-нитрогеназы), и Fe-зависимая, менее активна, чем обычная Mo-зависимая нитрогеназы.
Важную роль в образовании активной нитрогеназы играет вызревания Р-домена Mo-Fe-нитрогеназы, а предшественник Mo-Fe-кофактор нитрогеназы, шаперон GroEL, играет важную роль в завершении формирования нитрогеназы. Регуляция активности нитрогеназы может осуществляться образованием комплексов аргинина. Синтез нитрогеназы осуществляется под контролем группы т.н. nif-генов. Фиксация азота регулируется nifLA опероном, один из продуктув которого, NifA, регулирует транскрипцию nif-генов, а NifL имеет антагонистическое действие по отношению к действию NifA в ответ на поглощенный азот и в зависимости от поступления кислорода в клетки, экспрессия оперона nifLA регулируется по механизму положительной регуляции. NifL является флавопротеины, модулирующим активацию транскрипции генов фиксации азота путем редокс-зависимого переключения. Двухкомпонентная регуляторная система, состоящая из двух белков (энхансера NifA и рецептора NifL), образующих комплексы между собой, является атипичной для представителей рода, но не распространенной среди других организмов системой регуляции экспрессии генов.
Значение
Азотистый обмен почвы
Фиксация азота играет большую роль в круговороте азота в природе. В частности, фиксация азота является важнейшим источником азота, а представители рода Azotobacter играют важную роль в круговороте азота почвы, осуществляя фиксацию молекулярного азота. Также представители рода синтезируют некоторые биологически активные вещества, в том числе и некоторые фитогормоны, например ауксины, тем самым стимулируя рост и развитие растений и являясь биологическим стимулятором роста растений и синтезируя факторы, необходимые для их роста. Экзополисахариды представителей рода способствуют мобилизации тяжелых металлов в почве, способствуя самоочищению почв, загрязненных такими металлами, как кадмий, ртуть и свинец. Некоторые представители рода Azotobacter также способны к биодеградации некоторых ароматических соединений, содержащих хлор, например 2,4,6-трихлорфенолу, ранее викорисовувався как инсектицид, фунгицид и гербицид, однако обладает мутагенным и канцерогенным действием и является ксенобиотиком и типичным компонентом загрязнения сильськогоспорарських почв. Также Azotobacter производит некоторые вещества, предотвращающие роста определенных патогенов растений, таких как Alternaria, Fusarium и Helminthosporium, таком образом выступая в роли агента биологической борьбы с вредителями.
Использование человеком
Благодаря своей способности фиксировать молекулярный азот, тем самым повышая плодородие почв и стимулируя рост растений, бактерии Azotobacter широко используются в сельском хозяйстве, особенно в бывшем СССР, в частности для получения азотных биоудобрений, в том числе азотобактерин, также представители рода производят такие полисахариды как альгиновая кислота (E400), который используется в медицине как антацид, в пищевой промышленности как добавка к мозорива и кремов и в биоабсорбции металлов и поли-3-гидроксибутират. Azotobacter beijerinckii синтезирует рестриктазы Abe I, распознающий асимметричную семинуклеотидну последовательность CCTCAGC.