Рентгеноструктурный анализ

Технологический процесс для определения структуры молекулы методом рентгеноструктурного анализа. Сначала кристалл получается или выращивается в лаборатории, после чего он облучается для получения дифракционной картины в виде раздельных пятен. Кристалл постепенно оборачивается дифракционные картины собираются для каждой четкой ориентации кристалла. Используя преобразование Фурье, эти двумерные изображения превращаются в трехмерную модель электронной плотности в пределах кристалла. Расположения атомных ядер выводятся из этой электронной плотности и химических данных, образуя модель атомов в пределах элементарной ячейки кристалла. Рентгеноструктyрний анaлиз – метод исследования структуры вещества, в основе которого лежит явление дифракции рентгеновского излучения на трехмерных кристаллических решетках.
Для исследования атомной структуры применяют излучение с длиной волны порядка 1 A, то есть порядка размеров атомов. Вместе с нейтронографии и электронографии метод относится к дифракционных методов исследования структуры вещества.
Метод позволяет определять атомную структуру вещества, включающий пространственную группу элементарной ячейки, ее размеры и форму, а также определить группу симметрии кристалла. С помощью метода можно исследовать металлы и их сплавы, минералы, неорганические и органические соединения полимеры, аморфные материалы, жидкости и газы, молекулы белков, нуклеиновых кислот и другие вещества. Легким и успешным является применение метода для установления атомной структуры кристаллических тел, которые уже имеют строгую периодичность строения и фактически является созданными природой дифракционной решеткой для рентгеновских лучей. Для остальных веществ кристалл должен быть созданным, что является важной и сложной частью метода рентгеноструктурного анализа.
Факт явления дифракции рентгеновских лучей на кристаллах открыт Лауэ, теоретическое обоснование явлению дали Вульф и Брэгг (условие Вульфа-Брэгга). Как метод рентгеноструктурный анализ разработан Дебая и Шеррер. Рентгеноструктурный анализ и по сей день остается одним из распространенных методов определения структуры вещества через его простоту и относительную дешевизну.
Дифракция рентгеновских лучей на кристаллах была открыта в 1912 году немецкими физиками Максом фон Лауэ, Уильямом Фридриха и Паулем Книппинг. Направив узкий пучок рентгеновских лучей на неподвижный кристалл, они зарегистрировали на помещенной за кристаллом фотопластинке дифракционную картину, которая состояла из большого числа регулярно расположенных пятен. Каждое пятно – след дифракционного луча, рассеянного кристаллом. Рентгенограмма, полученная таким методом, позднее получившей название лауеграмы.
Разработанная Лауэ теория дифракции рентгеновских лучей на кристаллах позволила связать длину волны излучения с параметрами элементарной ячейки кристалла. Фактически было показано, что дифракционная картина кристалла представляет собой преобразование Фурье его двухмерной проекции. В 1913 году Лоренс Брэгг и одновременно с ним Г. В. Вульф предложили нагляднее трактовка возникновения дифракционных лучей в кристалле. Они показали, что дифракционные лучи можно рассматривать как отражение падающего луча от одной из систем кристаллографических плоскостей (дифракционное отражение или условие Брэгга – Вульфа).
В том же году Лоренс Брэгг вместе со своим братом Генри Брэггу впервые исследовали атомные структуры простых кристаллов с помощью рентгеновских дифракционных методов. В 1916 году американский физик Дебай и немецкий Пауль Шеррер предложили использование дифракции рентгеновских лучей для исследования структуры поликристаллических материалов. В 1938 французский кристаллограф Андре Гинье разработал метод рентгеновского малоуглового рассеяния для исследования формы и размеров неоднородностей в веществе.
Возможность использования рентгеноструктурного анализа для исследования широкого класса веществ и большая ценность этих исследований стимулировали развитие методов расшифровки структур. В 1934 году американский физик Артур Патерсон предложил исследовать строение веществ с помощью функции межатомных векторов (функции Патерсона). Американские ученые Дэвид Харкер, Джон Каспер (1948), Уильям Захариасен, Дэвид Сейр и английский ученый Уильям Кокрен (1952) заложили основы так называемых прямых методов определения кристаллических структур. Работы по исследованию пространственной структуры белков, начатые в 30-х годах в Великобритании Джоном Берналом и успешно продолжены Джоном Кендрю, Перуцем и другими сыграли важную роль в становлении молекулярной биологии. В 1953 году данные рентгенострустурного анализа, полученные Морисом Уилкинсом и Розалинд Франклин позволили Джеймсу Уотсону, Фрэнсису Крику создать модель молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты. С 50-х годов начали бурно развиваться методы обработки дифракционной информации и анализа этих данных с помощью компьютеров.
Кристаллизация
Кристалл белка под микроскопом. Кристаллы для рентгеноструктурного анализа имеют размеры от 0,1 до 1 мм.



Хотя рентгеноструктурный анализ может использоваться для характеризування расположения атомов в загрязненном или неблагоустроенном кристалле, в целом для точного определения структуры метод требует кристалла очень высокого уровня упорядоченности. Чистые упорядоченные кристаллы иногда формируются самопроизвольно в естественных или искусственных материалах, например металлах, минералах и других макроскопических веществах. Регулярность таких кристаллов иногда может быть усовершенствована с помощью отжига и других методов. Однако, во многих случаях, получение качественного пригодного для дифракции кристалла является главным барьером для определения его структуры на атомном уровне.
Обычно рентгеноструктурный анализ делится на анализ малых молекул и макромолекул, прежде всего через различные методы, используемые для получения качественных кристаллов. Малые молекулы целом имеют немного степеней конформационной свободы и могут быть кристаллизованные с помощью широкого набора методов, например вакуумного нанесения и рекристаллизации. В отличие от них, макромолекулы в целом имеют много степеней свободы и их кристаллизация должна осуществляться по условиям точного сохранения структуры. Например, молекулы белков и РНК не могут быть кристаллизованы, если их третичная структура развернутая, поэтому методы кристаллизации ограничены условиями сохранения нативного состояния таких макромолекул.
Кристаллы белков и других макромолекул почти всегда выращиваются в растворе. Самый общий подход – постепенное снижение растворимости его компонентов, если же это делается быстро, молекулы преципитирует из раствора, формируя аморфный осадок на дне сосуда. Рост кристаллов в растворе характеризуется двумя стадиями: нуклеация, т.е. образование микроскопического ядра кристалла (что имеет лишь порядка 100 молекул), и роста этого ядра до размеров, необходимых для анализа. Условия раствора, лучшие для первой стадии (нуклеации), – не всегда самые лучшие и для второй (роста кристалла). Таким образом, цель кристаллографов – создать условия, лучшие для роста одного крупного кристалла, так как большой размер позволяет улучшить качество метода. Обычно условия подбираются насприятливимы для нуклеации, но благоприятными для роста кристалла, таким образом первый кристалл поглотит большинство мателиалу с растворы, не оставляя возможности возникновения многочисленных микрокристаллов. В некоторых случаях кристаллограф удается подобрать условия образования лишь очень малых кристаллов. В таком случае один из таких кристаллов переносилься в другой сосуд, где он может продолжить рост. В некоторых случаях, крупные кристаллы могут разбиваются для получения небольших фрагментов, снова выращиваются для получения кристаллов вишои качеству.
Чрезвычайно трудно предусмотреть условия, оптимальные для роста идеально упорядоченных кристаллов. На практике, благоприятные условия часто устанавливаются с помощью скрининга – приготовление большого количества исследуемого вещества и испытания широкого разнообразия условий кристаллизации, часто сотни или даже тысячи. Для кристаллизации различных молекул используются различные физические механизмы снижения растворимости, например изменение pH, добавление солей гофмейстеривськои серии или снижающих диэлектрическую проницаемость раствора или крупных полимеров, такох как полиэтилен гликоль, выводящие молекулу вне фазу раствора через энтропийный эффект. Часто испытываются различные температуры для подбора скорости кристаллизации или для создания перенасыщенного раствора. Эти методы требуют большого количества исследуемого вещества восокого степени очистки, которые, например, в случае белков, часто бывает трудно получить. Для экономии вещества были разработаны роботы, способные распределять количества вещества порядка 100 нанолитрив, что позволяет уменьшить затраты вещества.
Известно несколько факторов, препятствующих кристаллизации. Например, кристаллы целом держат при постоянной температуре и защищают от вибраций, которые препятствовали бы получению качественного кристалла. Примеси в растворе часто враждебные к кристаллизации. Конформационная гибкость в молекуле также стремится уменьшить вероятность образования упорядоченного кристалла. Интересно, что вещества, способные к самосборке в регулярные структуры, часто склонны собираться в кристаллы. Кристаллы могут портиться сообщением нескольких центров кристаллизации, хотя современные вычислительные методы способны получать структуру некоторых из таких кристаллов. Часто если кристаллизация не удается для какого-то вещества, кристаллограф пробует несколько модифицированную молекулу, даже мелочи в молекулярных свойствах могут приводить значительной разницы в свойствах ее кристаллизации.
Сбор данных
Закрепление образца
Источники излучения
Дифрактометр



Для облучения кристалла требуется монохроматический источник рентгеновского излучения. Яркие и полезные источники рентгеновского излучения – синхротроны, большая яркость их света позволяет получения наилучшей разрешения. Они также удобны для регулирования длины волны излучения, что полезно, наприкад, для фазового анализа с помощью метода многоволновой аномальной дисперсии (MAD), описанного ниже. Синхротроны обычно очень ценные и существуют только в государственных научных центрах, где они используются каждую минуту дня и ночи.
В лабораториях используются меньшие и более слабые источники рентгеновского излучения, обычно для проверки качества кристаллов перед проведением исследований с помощью синхротрона и для получения грубого анализа вещества. В таких системах, электроны вылетают из катода и ускоряются за помощью электрического потенциала порядка 50 кВ, после чего бомбардируют металлическую пластину, что приводит для получения тормозного излучения и рекомбинантного излучение в виде нескольких сильных спектральных линий, соответствующего возбуждению электронов внутренних орбиталей атома металла. В качестве материала этой пластинки общее используемый медь, которую легко охлаждать за ее высокой теплопроводности, получая яркие линии K ? and K ?. Линия K ? иногда видалаеться посредством тонгоко слоя (0,01 мм) никелевой фольги. Эти источники дают около 2 кВт излучения в самом обычном варианте и до примерно 14 кВт в дорогих вариантах.
Полученное рентгенивсь излучения обычно фильтруется для получения единой длины волны (монохроматического излучения) волны и колимуеться перед подачей на кристалл. Фильтрация не только упрощает анализ данных, но и устраняет излучение, ухудшает кристалл без добавления полезной информации. Коллимация делается либо с помощью коллиматор (обычно длинной металлической трубки), или определенным расположением слабо искривленные зеркал. Зеркальным системам отдается предпочтение для маленьких кристаллов (до 0,3 мм) или с кристаллам с большим размером кристаллического ячейки (более 150 A).
Запись отражений
Анализ данных
Симметрии кристалла
Фазовый анализ
Построение модели
Другие методы рентгеноструктурного анализа
Метод Лауэ
В методе Лауэ узкий (немонохроматичний) пучок рентгеновских лучей (или нейтронов) направляется на неподвижно закреплен монокристаллический образец. Этот пучок включает рентгеновские лучи с набором длин волн в широком интервале значений. В кристалле происходит «отбор», и дифрагирует только излучение с дискретным набором длин волн ?, таких, что для этих длин волн межплоскостных расстояния d и углы падения ? удовлетворяют закону Брэгга. Метод Лауэ чрезвычайно удобен для быстрого определения симметрии кристалла и его ориентации. Он используется также для определения размеров искажений и дефектов, возникающих в кристалле при механической и термической обработке.
Схема камеры Лауэ. Источник рентгеновских лучей испускает излучение, имеющее сплошной спектр, с длинами волн, например, от 0,2 A до 2A. Система диафрагм позволяет получить хорошо колимований пучок. Размеры монокристаллического образца могут не превышать 1 мм. Плоская рентгеновская пленка располагается так, что на нее попадают или проходные или отражены дифрагированные пучки. Дифракционная картина состоит из серии пятен (рефлексов), на рис. 2. показана такая дифракционная картина для кремния. Каждая плоскость кристалла, отражающей выбирает из падающего пучка излучения с той длиной волны, удовлетворяет закону Брэгга 2dsin? = п?. Получаемая дифракционная картина характеризует симметрию кристалла: если кристалл, имеющий ось симметрии четвертого порядка, ориентированный так, что эта ось параллельна падающему пучку, то лауеграма также будет иметь ось симметрии четвертого порядка, Лауеграмы широко используются для ориентации кристаллов при экспериментальном изучении различных твердых тел.
Метод Лауэ практически никогда не применяется для определения кристаллической структуры. Дело в том, что та же атомная плоскость может давать несколько отражений различных порядков, так как для получения лауеграм используется широкий интервал значений длин волн; поэтому отдельные пятна на лауеграми могут оказаться результатом наложения отражений разных порядков. Это затрудняет определение интенсивности данного отражения, что, в свою очередь, затрудняет определение базиса.
Методы исследования поликристаллов



Методы исследования аморфных веществ
Исследование угольного вещества
Рентгеновская дифрактометрия проводится под большими, под средними и под малыми (