Трансформация (генетика)

Трансформация - генетическая модификация клетки путем введения и дальнейшей экспрессии в ней инородного генетического материала (ДНК).

Сейчас общая лабораторная процедура в молекулярнии биологии. В 1944 году эффект был впервые продемонстрирован Освальдом Авери, Колином Маклеодом и Маклин Маккарти, которые провели перенес гена к бактерии Streptococcus pneumoniae. Авери, Маклеод и Маккарти назвали такое перенес ДНК и, как следствие, экспрессию перенесенных генов трансформацией.

История открытия

1928 - Фредерик Гриффит превращает непатогенных бактерий Pneumococcus в патогенные, смешивая их с убитыми патогенными бактериями.
1944 - Освальд Авери, Колин Маклеод и Маклин Маккарти обнаруживают, что преобразующим фактором является ДНК и называют процесс трансформацией.
Трансформация vs. трансфекция

В использовании этих терминов в современной биотехнологии есть определенные нюансы. Исторически "трансформация"означала фенотипические изменения, вызванные экспрессией чужеродного гена в организме. А процесс переноса чужеродной ДНК называли "трансфекции". Говорили, что трансфекция приводит к трансформации: "the transfection leads to a transformation".

Со временем эти нюансы размылись и встраивание чужеродного гена в геном автоматически называется трансформацию. Впрочем, в животной генной инженерии оставшийся срок трансфекция, означающий перенес молекулярного вектора, содержащего ген, в клетку, не приводит к встраивания его в геном. Зато в растительном биологии подобный термин не прижился и в случае переноса вектора без встраивания гена в геном называют транзиентной, т.е. временной, трансформации.

В случае бактерий, термин «трансформация» не используется, если генетические изменения были вызваны процессами трансдукции или конъюгации, при которых передача ДНК осуществляется с помощью бактериофагов и коньюгаторних плазмид.

Механизмы

Бактерии

В бактериях для описания процессов трансформации используется термин компетентность - состояние, когда бактерии обладают способностью принимать ДНК из внешней среды. Существуют две формы компетентности, естественная и искусственная.

Естественная компетентность

Бактерии многих видов (возможно, большинства) естественно способны к принятию ДНК. В состоянии компетентости бактерии вырабатывают особый низкомолекулярный белок (фактор компетентности), что активирует синтез автолизину, эндонуклеазы и ряда факторов транскрипции. Автолизин частично разрушает клеточную стенку, что способствует проникновению ДНК через нее, а также снижает чувствительность бактерий к осмотическому шоку. В состоянии компетентности также снижается общая интенсивность метаболизма.

Эволюционная функция генов, кодирующих вышеупомянутые энзимы, спорная. Хотя большинство учебников и исследователей предполагают, что клетки принимают ДНК, чтобы приобрести новые версии генов, простым объяснением, которое соответствует большинству наблюдений, является то, что клетки принимают ДНК преимущественно как источник нуклеотидов, которые могут использоваться непосредственно или быть метаболизированных и использоваться для других целей. Чаще всего бактерии, естественно подвергаются трансформации, экспрессирующих свои гены компетентности только в специфических условиях, часто в ответ на пищевой давление. Как только ДНК попадает в цитоплазме клетки, она часто разрезается клеточными нуклеазами, или благодаря процессу генетической рекомбинации она может быть встроена в бактериальный геном. Естественная трансформация эффективна в случае линейной ДНК, но не кольцевой ДНК плазмид.

Искусственная компетентность

Искусственная компетентность не кодируется в генах клеток. Вместо этого, она вызывается лабораторными процедурами, в которых клетки пассивно делаются проницаемыми для ДНК, используя условия, которые обычно не встречаются в природе. Эти процедуры сравнительно легкие и простые, и широко используются в молекулярной биологии и генной инженерии бактерий. Искусственно компетентные клетки стандартных бактериальных штаммов также производятся коммерчески, их можно приобрести замороженными и готовыми к использованию.

Охлаждение клеток при наличии двухвалентных катионов, например Ca2 + (в CaCl2), делает клеточные мембраны более проницаемыми к плазмидной ДНК. Бактерии культивируются с ДНК, а затем внезапно нагреваются (до 42 ° C в течение 30-60 секунд), что заставляет ДНК к проникновению в клетку. Этот метод хорошо работает для кильцьовои ДНК плазмид, но не для линейных фрагментов хромосомной ДНК. Эффективность трансформации для высоко компетентных клеток составляет около 108 случаев трансформации на мкг ДНК плазмиды. Низко-компетентные клетки дают 104 / мкг или меньше. Хорошие непромышленные подготовки должны предоставить 105-106 трансформаций на мкг ДНК плазмиды. Максимальное количество компетентных клеток наблюдается в конце фазы логаритмичного роста и при дальнейшем строгом соблюдении низких температур (4 ° C) среды при приготовлении клеток.

Электропорация - другой способ создания отверстий в клетках, внезапно шокируя их электрическим током с напряжением 100-200 В/ мм плазмидная ДНК может проникнуть в клетку через эти отверстия. Природные механизмы восстановления мембраны впоследствии латают эти отверстия. Особенность этого метода заключается в том, что среда, в которой находятся клетки, должны быть обессоленная для предотвращения короткого замыкания.

Плазмиды содержат последовательности, которые позволяют им реплицироваться в клетке независимо от хромосомы. В экспериментах используются плазмиды, содержащие ген устойчивости к антибиотикам и бактериальные штаммы, которые не имеют устойчивости к этому антибиотику (так называемая селекция). Поэтому, только трансформированные бактерии могут выжить на селективном среде с этим антибиотиком. Например, плазмида, содержащая ген, кодирующий белок ß-лактамазу (то есть содержит bla-ген), делает бактерий устойчивы к ампициллину. Бактерии затем выращиваются на среде с ампициллином, убивая бактерий, которые не приняли bla-ген.

Другой способ детекции клеток, прошедших трансформицию, - скрининг, т.е. использование генов, делают трансформированы бактерии визуально отличными. Например, для этого используется галактозидазной тест или экспрессия флюоресцентных белков, таких как GFP.

Дрожжи и другие грибы

Известно несколько методов трансформации дрожжей:

Высокоэффективная трансформация (High Efficiency Transformation) согласно протоколу, предложенному Gietz и Woods [1]
Двух-гибридный протокол (Two-hybrid System Protocol): Двух-гибридная система привлекает использование двух различных плазмид в единой клетке дрожжей. Одна плазмида содержит ген или последовательность ДНК, должны быть внесены в клетки, а другая плазмида содержит библиотеку генома или кДНК (cDNA) [1].
Быстрый протокол трансформацииRapid Transformation Protocol) - см. ссылка на статью Gietz / Wood выше.
Протокол замерзших дрожжей (Frozen Yeast Protocol) позволяет приготовления замерзшие клеток дрожжей, компетентных для трансформации после размораживания.
Генетическая пушка (Gene Gun Transformation) - бомбардировки клеток золотыми или вольфрамовыми частицами покрытыми ДНК.
Протопластна трансформация (Protoplast Transformation) - грибные споры могут быть превращены в протопласты, который могут прийниматы ДНК из раствора и трансформироваться.
Растения

Доступные механизмы переноса ДНК в растительных организмов включают:

Трансформация с помощью Agrobacterium tumifaciens. Agrobacterium tumifaciens - это естественная бактерия, которая паразитирует на растениях и содержит специальную Ti - плазмиду, в состав которой входит Т-ДНК, способная проникать в клетку растения хозяина и встраиваться в геном, а также vir-гены, ответственные за процесс переноса ДНК. Т-ДНК содержит гены синтеза жидких аминокислот и углеводов (мнений), которыми питается бактерий, а также гены фитогормонов, вызывающие опухолевидное рост растительных тканей. Рецепторы на поверхности бактерии воспринимают продукты разложения растительной клеточной стенки, в результате чего активируются vir-гены, продукты которых способствуют процессу переноса Т-ДНК в растительную клетку. Сама бактерия в растительную клетку при этом не попадает. Для генетической трансформации растительной клетки используют бинарную веторну систему, состоящую из плазмиды, содержащей Т-ДНК, где гены синтеза мнений и пухлиноутворюючих фитогормонов заменены на целевой ген, который должен встроиться и хелперно плазмиды, содержащей vir-гены, обслуживающих процесс переноса ДНК. Растительная ткань (чаще всего, листья) нарезается на мелкие куски, (около 10x10 мм) и помещается на 10 минут в среду с Agrobacterium, содержащий плазмиду для переноски. Способность растений образовывать на месте ранения меристематических ткань, которая при определенных условиях (фитогормонального составе среды in vitro) способна к регенерации и образует вегетативные побеги из отдельных трансформированных клеток. Далее растения выращиваются на селективном среде.
Некоторые виды растений могут быть трансформированы методом in planta путем вакуумного "присасывания" агробактерии к растительной ткани. Это может быть как стабильная трансформация путем заражением цветков (в таком случае трансформируется эмбриональная ткань), а затем посевом семян на селективное системе или транзиентной, путем вакуумной инфильтрации ДНК в листок.

Генетическая пушка, или баллистическая трансформация: Маленькие золотые или вольфрамовые частицы покрываются чужеродной ДНК и выстреливаются в молодые растительные клетки или эмбрионы. Некоторое генетический материал останется в клетках и трансформирует их. Этот метод также позволяет трансформацию растительных органелл - пластид. Эффективность трансформации ниже, чем при трансформации посредством Agrobacterium, но большинство растений могут быть трансформированы этим методом.
Электропорация: как и с бактериями, отверстия в клетках растений делаются, используя электрический ток.
Вирусная трансформация: Генетический материал упаковывается в соответствующем растительном вирусе, а затем измененный вирус используется для инфекции растения. Геномы большинства растительных вирусов состоят из одно-цепной РНК, который реплицируется в цитоплазме зараженной клетки. Так этот метод является трансфекции, а не реальной трансформацией, потому что вставленные гены никогда не достигают ядра клетки и не объединяют с его геномом. Потомки зараженных растений свободные от вируса и от вставленного гена.

Животные

Микроинъекция: использование очень тонкой иглы для инъекции ДНК непосредственно в ядро эмбриональных клеток.
Вирусная преобразования: Аналогично случае с растениями, генетический материал упаковывается в вирусе, который доставляет его в клетки. В отличие от растений, у животных этот метод часто приводит к действительной тансформации.