Убиквитин-зависимый протеолиз

Убиквитин-зависимый протеолиз - процесс гидролиза (расщепление) аномальных и уже ненужных белков организма, осуществляемой так называемой убиквитин-протеасомною системой. Процесс включает два этапа: ковалентные присоединения цепочки молекул убиквитина и деградацию белка протеосомой.

Функции протеолиза

Клеткам нужен механизм деградация белков, уже выполнили свою функцию и становятся ненужными. Дальнейшее присутствие таких белков в клетке может ей навредить, кроме того, нужны аминокислоты для синтеза других белков, а перегрузка цитоплазмы полипептидами может индуцировать апоптоз. Долгое время внутриклеточный протеолиз считали неспецифическим процессом, настоящим прорывом в этой области стало открытие убиквитин-зависимого протеолиза. Среди субстратов специфического протеолиза имеются регуляторы клеточного цикла, компоненты различных сигнальных путей, мутантные белки, а также повреждены посттрансляционной. Долго считали, что такой протеолиз может иметь место только для белков цитоплазмы и, возможно, ядра. Сейчас стало ясно, что эта система работает и для белков связанных с мембранами, белков, секретируемых (для этого требуется обратное перемещение белка в клетку). Система внутриклеточного протеолиза задействована в процессах пролиферации, дифференциации клеток, реакциях на стресс и патогены, репарация ДНК. Дефекты в этой сложной системе могут быть причиной нарушений метаболизма, развития рака и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона.

История открытия

1980 опубликованные статьи в PNAS Ирвином Роузом, Авраамом Гершко и Аароном Чехановер, где говорилось о присоединении убиквитина к белков для их напрямлення в протеасомы, для дальнейшего протеолиза. Данные о том, что внутриклеточный протеолиз является АТФ-зависимым были впервые получены Мелвином Симпсоном 1953 года. Это было непонятно, поскольку гидролиз пептидной связи является екзергоничним процессом и не требует энергии. Позже, когда в 1970-х лаборатория Голдберга показала, что клетка быстро очищается от поврежденных и ненормальных белков, а также, что белки задействованы во внутриклеточном сигналюванни живут недолго, стало понятно, что энергия может потребоваться для контроля протеолиза. В своих работах Гершко и Цихановер показали, что протеолиз может осуществляться в безлизосомних лизата клеток и для этого необходимо наличие двух фракций APF-1 (ATP-dependent proteolysis factor 1) низкомолекулярный белок, позже названный убиквитин, и APF-2 - высокомолекулярная фракция, стабилизировалась АТФ и представляла собой, как выяснилось потом активные протеасомы. Сначала они думали, что APF-2, это киназа, что нефосфорилирующие APF-1 или какие другие белки, с ним взаимодействуют. Они инкубировали меченую фракцию APF-1 с APF-2 в присутствии АТФ, оказалось, что APF-1 связывался с белками во фракции APF-2, к большому удивлению ковалентно. Было понятно, что такое связывание необходимо для протеолиза, но оставалось неясно, APF-1 связывался с субстратами или ферментами протеолиза. Ковалентного связывания двух белков было явлением редким, но не беспрецедентным, в то время было показано, что гистон Н2А может быть модифицирован ковалентным присоединением маленького белка - убиквитина. Анализ показал, что APF-1 и является убиквитин. Позже было выяснено, что убиквитин является меткой для протеолиза белков, обнаружены убиквитин-лигазы, обеспечивавших присоединения убиквитина к белкам, ферменты «деубиквитинизации», другие белки, которые могут ковалентно модифицировать субстраты.

Гершко, Роуз и Цихановер получили Нобелевскую премию по химии 2004 года за открытие убиквитин-зависимого протеолиза.

Механизм присоединения убиквитина к молекуле субстрата

Деградация белка по убиквитиновому пути включает два этапа: ковалентные присоединения полиубиквитинового цепочки и деградация белка 26S протеосомой. Убиквитин - это пептид, состоящий из 76 аминокислот. Его присоединения к белку проходит в три этапа с участием трех групп ферментов E1, E2 и Е3.

Фермент Е1 активирует убиквитин, гидролизующие АТФ. При этом формируется макроэргических связь между С-концевым глицином убиквитина и цистеином Е1. этот процесс универсален для любого убиквитинового пути, поэтому клетке достаточно одного варианта Е1.
Активированный убиквитин переносится на остаток цистеина белка Е2 (UCP-ubiquitin carrier protein). Клетка содержит несколько вариантов Е2 (например у дрожжей 13). Каждый вариант может участвовать в ограниченном количестве убиквитинових путей, определяется его способностью взаимодействовать с одним или несколькими типами Е3. Есть молекулы Е2, которые могут переносить убиквитин непосредственно на белок без участия Е3.
Белки класса Е3 - это убиквитин лигазы, способные специфически связываться с белковыми субстратами, подлежащих протеолиза, прямо или через белок-помчник. Е3 катализирует образование пептидной связи между С-концом убиквитиновои единицы и аминогруппой лизинового остатка субстрата (если это первый убиквитин, присоединяемый к субстрату) или лизина 48 предварительной молекулы убиквитина. Е3 узнают определенный мотив в составе субстрата, что называется дегроном - на уровне Е3 обеспечивается специфичность протеолиза. Вариантов Е3 очень много в клетке.
Убиквитин лигазы могут узнавать мотив, констинутивно входит в состав белка. Например N-концевой аминокислотный остаток. Но это еще не свидетельствует о том, что белок, содержащий такой мотив должен деградировать. Обычно дегрон находится вблизи части молекулы, которая непосредственно отвечает за выполнение функций белка, и если белок нормально скрученный дегрон недоступен для убиквитин-лигазы. Также может происходить узнавания белка, который был определенным образом модифицированный, например - фосфора, или узнавание субстрата в комплексе с соответствующим адапторним белком.

Протеасома

После присоединения убиквитина белок направляется в протеасому, где и осуществляется его протеолиз. Протеасомы содержатся в цитоплазме и ядре клетки, но их нет внутри органелл. 26S Протеасома состоит из сердцевинного каталитического комплекса 20S, с двух сторон которого находятся регулирующие субъединицы 19S. 20S комплекс построен из четырех колец, каждое из которых состоит из семи субъединиц, кодируемых 14 генами - 7 различных α-субъединиц и 7 различных β-субъединиц. В β-кольцах размещены три каталитические сайты:

трипсин-подобный сайт - узнает остатки тирозина и фенилаланина
хемотрипсином-подобный сайт - узнает остатки лизина и аргинина
сайт, осуществляющий гидролиз цепи после остатка глутамина.
Каждый сайт построен из двух одинаковых субъединиц в разных кольцах. Кроме этих трех видов сайтов, конститутивно входят в состав протеасомы, есть еще такие, которые могут индуцироваться лишь в определенных условиях. α-кольца необходимые для стабилизации β-колец и для связывания с 19S комплексами. 19S комплекс обладает АТФазну свойством и отвечает за узнавание полиубиквитинових белков. 20S цилиндр может также связываться с 11S комплексами, в таком случае Протеасома не сможет действовать на интактные белки, но способна осуществлять протеолиз коротких пептидов.

Деградация белков, ассоциированных с мембраной несколько отличается от протеолиза цитоплазматических белков:

происходит в лизосомах
для напрямлення белка в лизосом достаточно присоединения одного остатка убиквитина
в случае формирования полиубиквитинового цепи связывание происходит по 63 лизина.
Отщепление убиквитина из комплексов

Отщепление требуется для высвобождения убиквитина после гидролиза белка, для исправления ошибочного убиквитинування, кроме того убиквитин синтезируется в форме неактивного полипопередника - его еще нужно нарезать на функциональные молекулы. Белки, осуществляющие отщепление убиквитина относятся к тиоловых протеиназ, они делятся на два класса: • С-конечные убиквитин гидролазы (UCH) осуществляют котрансляцийний процессинг полиубиквитинового предшественника, а также отщепление убиквитина из комплексов с небольшими молекулярными массами - аминами и тиолами. • Убиквитин специфические протеазы (UBP) или изопептидазы - отщепляет убиквитин от клеточных белков. В клетке есть много видов этих ферментов.

Особенности убиквитин-зависимого протеолиза белков

Убиквитин зависимый протеолиз есть только у эукариот, хотя протеасомы есть и прокариот и у архей, но у них кепюча субъединица сразу узнает субстрат, таким образом число субстратов является сильно ограниченным. При убиквитинуванни число субстратов значительно больше, вследствие наличия большого количества ферментов и возможности их комбинирования. Вторым преимуществом убиквитинування является то, что оно обратимо. Для напрямлення белка в протеасому недостаточно одного остатка убиквитина, пока синтезируется полиубиквитиновий цепь клетка имеет время «подумать». Таким образом обеспечивается гибкость системы протеолиза.